核酸定量

在分子生物学中，核酸的定量通常是为了确定混合物中DNA或RNA的平均浓度，以及它们的纯度。使用核酸的反应通常需要特定的数量和纯度才能达到最佳性能。 

紫外分光光度分析是基于核酸以特定模式吸收紫外线的原理。在DNA和RNA的情况下，样品暴露在波长为260 nm的紫外线下，光电探测器测量通过样品的光。一些紫外线会通过，另一些会被DNA / RNA吸收。样品吸收的光越多，样品中的核酸浓度就越高。由此产生的结果是，撞击光探测器的光线会减少，这将产生更高的光密度（OD）。

使用Beer-Lambert定律可以将吸收的光量与吸收分子的浓度联系起来。在波长为260 nm时，双链DNA的平均消光系数为0.020 (μg/ml)-1cm-1，单链DNA的消光系数为0.027(μg/ml)-1cm-1，对于单链RNA为0.025(μg/ml)-1cm-1，对于短的单链寡核苷酸，它取决于长度和碱基组成。因此，1个吸光度单位（1 Abs）对应于双链DNA的浓度为50 μg/ml。这种计算方法对最高2个吸光度单位（2 Abs）的核酸样品有效。对于寡核苷酸可能需要更准确的消光系数，可以使用nearest-neighbor模型。

计算

光密度（Optical Density, OD）由以下公式生成：

光密度 OD = log (入射光强度/透射光强度)

在实际应用中，一个不含DNA或RNA的样本不应该吸收任何紫外线，因此产生的OD值是0。

光密度 OD = log (100/100) = 0

当使用分光光度法来测定DNA或RNA的浓度时Beer-Lambert定律用于确定未知的浓度，而不需要标准曲线。本质上，Beer-Lambert定律使得将吸收的光量与吸收分子的浓度联系起来成为可能。以下的单位吸光度与核酸浓度转换因子将OD转化为未知核酸样本的浓度：

A260 dsDNA = 50 μg/ml

A260 ssDNA = 33 μg/ml

A260 ssRNA = 40 μg/ml

转换因子

当使用10 mm的光程长度时，只需将OD值乘以转换因子来确定浓度。例如，一个2.0 OD的dsDNA样本对应的浓度是100 μg/ml。

当使用小于10mm的光程长度时，由此产生的OD将根据转换因子相应地减少（10mm/实际光程长度）的倍数。使用上述光程长度为3 mm的例子，100 μg/ml样品的OD值将降至0.6。为了将浓度归一化为10mm当量，需要执行以下操作：

0.6 OD x (10/3)*50μg/ml=100μg/ml

大多数分光光度计允许选择核酸类型和光程长度，根据Beer-Lambert定律的原理，将浓度归一化为10 mm的光程长度下计算。

样品纯度（260:280 / 260:230比值）

核酸样本通常会被其他分子（例如：蛋白、有机化合物）污染。使用分光光度法分析进行核酸定量的第二个好处是能够使用260 nm:280 nm的计算来确定样品的纯度。用260 nm和280 nm处的吸光度比值（A260/A280）来评估核酸的纯度。对于纯的DNA，A260/A280被广泛认为是~1.8。对于纯的RNA， A260/A280的比值为~2.0。这些比率通常用于评估核酸分离过程中残留的蛋白质污染量，因为蛋白质在280 nm处吸收。

260 nm与280 nm处的吸光度比值通常用于评估蛋白质溶液的DNA污染，因为蛋白质（特别是芳香族氨基酸）在280 nm处吸收光。然而，相反的情况并非正确——它需要相对大量的蛋白质污染会显著影响核酸溶液中260:280的比例。

260:280的比值对蛋白质中的核酸污染具有较高的敏感性：

260:280比值对核酸中的蛋白质污染缺乏敏感性（表中所示为RNA，100%DNA约为1.8）：