介绍    

欧洲药典 (European Pharmacopoeia, EP) 第2.2.25章关于紫外和可⻅光谱法（或分光光度法）的内容已在细节和范围上进行了⼴泛修订，新版10.0⾃2020年1⽉1⽇起强制执行。⼀个重⼤变化是范围现在扩⼤到包括高效液相色谱 (HPLC) 检测器和过程分析技术 (PAT) 作为紫外/可⻅ (UV/Vis) 分光光度法的应⽤。这与最新的美国药典（US Pharmacopeia, USP）第<857>章紫外-可⻅光谱法存在很⼤差异，该章⾃2019年12⽉1⽇起强制执行，其中明确将HPLC检测器排除在其范围之外。与基本分光光度法相⽐，HPLC和PAT都是更具动态性和系统特异性的技术，需要考虑的变量更多，因此，为简单起⻅，本⽂仅涵盖适⽤于基本分光光度法的新法规。新版本介绍了⼀些新的仪器鉴定⽅法，并提出了鉴定测量的新参考材料。

下⾯讨论该标准的重⼤变化及其对仪器⽤⼾的实际影响。

⼀般测量原则

这⼀主题在之前的版本9.2中基本没有出现， 但已经在10.0版进行了⼴泛的重写和扩展。虽然本节的⼤部分内容描述了UV/Vis测量中，有⼀些新的具体注意点：

UV/Vis的定义：根据EP的⽬的，UV区域现在定义为180 nm⾄400nm，可⻅光区域为400nm⾄800nm。

建议⽤⼾：“定义测量条件以获得令人满意的信噪⽐，并选择扫描范围、扫描速率和狭缝宽度，以提供预期应⽤所需的光学分辨率，⽽不会损失所需的信噪⽐或分析⽅法的线性度。”当然，这只是⼀种好的做法，但也建议在使⽤⼆极管阵列仪器时，“⽆需调整光束尺⼨、扫描范围、扫描速率或狭缝宽度，因为光学分辨率通常是固定的，并且始终记录全光谱”。有解释如果这些固定参数不能产生合适的信噪⽐或线性度，该怎么办。

比色皿

已修订了对比色皿光学质量的要求。9.2中规定光程公差为±0.005厘米。该公差已修订为 ±0.5%，当然对于1厘米的比色皿来说，相当于±0.005厘米，但是，当应⽤于更短光程⻓度的比色皿时就会出现问题。

虽然10毫米光程的±0.5%公差完全在⼤多数比色皿供应商的实际能力范围内，但随着光程的缩短，±0.5%公差变得不切实际。这意味着1毫米光程的比色皿的公差将是±5µm，⽽即使是最有信誉的供应商也只报出±10µm的公差。虽然 ±5µm 是可能的，但它会⼤⼤增加成本，使这种比色皿作为⽇

常工具变得不经济。此外，从逻辑上讲，光程为10µm的⽐色⽫将具有不可测量的±0.05µm公差。这使⽤⼾陷⼊了困境，因为应⽤简单的百分⽐在实践中不起作⽤。9.2中还有⼀项要求：“当充满相同溶剂时，⽤于盛放待测溶液和补偿液的比色皿必须具有相同的透射率”。 术语“相同”是⽆法量化的，现在已在10.0中进行了澄清：“⽯英比色皿的比色皿吸光度 <0.093A@240 nm，玻璃⽐色⽫的⽐色⽫吸光度 <0.035 A@650 nm在⽀架中旋转180°时，绝对差值<0.005A。”

设备性能控制

合规性所需的仪器资格在10.0中根据所进行的分析的⽬的进行定义，如表1所示，取⾃标准。

表1表明仪器带宽对于定性分析并不重要，但应该记住，如果被检查的光谱包含尖锐或复杂的吸收带，则测量的峰的波⻓和吸光度可能取决于分光光度计的分辨率，并且可能仅仅由于仪器解析相邻光谱特征的能力或缺乏该能力⽽出现偏移。因此，在这种情况下应谨慎行事，并且可能建议采⽤分辨率资格流程。

标准的前⼀版本包含⼀组简单的测试，⽤于评估仪器在波⻓和吸光度准确度、杂散光和分辨率⽅⾯的性能。如果仪器通过了这些测试，则可以声称其“符合药典要求”。这种⽅法存在潜在的缺陷，即在⼀组操作条件下进行的仪器鉴定可能不适⽤于使⽤不同条件进行的分析。例如，使⽤氘灯作为光源在紫外线下进行的鉴定可能⽆法描述如果使⽤钨⻧素光源在可⻅光区域进行实际分析会发生什么。虽然新标准要求相同的参数需要鉴定，现在的要求是证明仪器具有进行实际分析所需的性能。这⼀直是GxP协议的⼀般要求，但直到现在才明确说明。因此，⽤⼾必须确定系统在分析中将使⽤的参数值范围，并证明在该范围内符合要求。这样做的后果之⼀是，过去经常采⽤的简单⽅法（对每个参数进行⼀次鉴定测试）可能不够⽤。事实上，该标准现在还要求对光度线性进行鉴定；这肯定意味着将需要多种具有准确吸光度值的参考材料。该标准还建议，⽤于鉴定的参考材料的指定参数值应“括住”拟议分析中要使⽤的值，以便进行几种不同分析的实验室可能需要选择⼀系列不同的参考材料来证明完全符合要求。这些可以是购买的“认证参考材料”（Certified Reference Materials, CRM），例如适当密封容器中的固体过滤器或液体过滤器，也可以是“实验室制备的溶液”。CRM⽐实验室制备的溶液有几个优势，稍后将对此进行讨论。

波长准确度的控制

⽤⼾必须：“使⽤⼀种或多种参考材料控制⽬标光谱范围内适当数量的波段的波⻓准确度”和“建议测试⾄少2个涵盖预期光谱范围的波⻓” 提出了选择具有峰值波⻓的参考材料（⻅表 2）。

所有溶液和固体滤光片均可作为CRM在市场上买到。请注意，这些材料中使⽤的稀土元素的光谱包含尖峰，因此测量的峰值波⻓可能会随仪器分辨率⽽变化。良好的波⻓CRM将具有在不同带宽值下认证的波⻓，⽤⼾应使⽤分析专论中指定的带宽来验证仪器。

多年来，氧化钬溶液⼀直被⽤作波⻓参考，但对于低于240nm的波⻓，现在建议在此“远紫外”区域使⽤峰值低⾄201nm的氧化铈溶液。

玻璃滤光⽚可能被认为⽐⽐色⽫中的液体参考物更坚固，但波⻓强度值可能与熔融体不同批次而略有不同，因此此类滤光片应单独认证。液体比色皿可以清洗（⼩⼼），因为光学抛光的⽯英表⾯可以恢复“干净”的光学特性；但是，不建议对玻璃滤光片这样做，因为根据定义，清洗可能会改变光学表⾯的特性，从⽽使认证⽆效。

原⼦谱线（例如汞、氖或氙的谱线）是主要的物理标准和最终的波⻓参考，因此始终被认为适⽤于仪器鉴定。但是，需要注意的是，正如美国药典第<857>章所述：“原⼦发射源的弧或其图像需要位于与光谱仪主光源图像相同的光路中；因此，它只能⽤于可在单光束强 度模式下操作的光谱仪，并且实际上只能在设计⽤于容纳这些光源的系统上实施”。通常⽤作分光光度计光源的内置氘灯和氙灯位于光路中，并且具有发射线，如果仪器能够进行单光束操作，它们可以提供有⽤的常规波⻓检查。但是请注意，仅参考可⻅波⻓，因此它们不适合⽤于紫外线鉴定。

上述列表并⾮规定性的，因此如果需要鉴定⽽推荐的材料均不适⽤，则可以使⽤其他CRM。例如，对于那些需要在更低的紫外线波⻓下鉴定的人，领先的参考材料生产商（Reference Material Producer, RMP）可提供“深紫外线”CRM，其认证峰值低⾄191nm。⼀些具有宽光谱带宽的简单仪器可能⽆法分辨所列参考的尖锐波段，对于这种情况，⼀家 RMP 提供的特殊配制的“绿色染料溶液”是⼀种 CRM，可⽤于鉴定带宽高达12nm的波⻓（和吸光度）。

⽆论使⽤什么参考材料，EP对台式分光光度计的允许误差为：波⻓低于400 nm 时为±1nm， 波⻓高于400 nm时为±3nm。

吸光度准确度的控制

10.0 的这⼀部分对传统实践进行了几项改变，并且在某些地⽅可供解读。酸性介质中的重铬酸钾溶液多年来⼀直是⾸选的吸光度参考材料，并9.2中被引⽤⽤于235、257、313、350 和430nm的鉴定。实验室可以选择使⽤市售的CRM和⼤多数受监管的实验室可能已经拥有⼀个或多个此类参考材料。然⽽，最新版本中并未引⽤该参考材料，现在建议使⽤烟酸溶液。EDQM（European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare）⽹站还指出，10.0 包括：“引⼊烟酸作为重铬酸钾的替代品（REACH附件XIV）来控制吸光度准确度”。

这意味着重铬酸钾对操作人员构成危害，但对REACH法规的详细审查表明，即使在实验室中制备重铬酸钾溶液，在⽤于仪器鉴定的浓度和数量下，⻛险也微乎其微，⽽当使⽤永久密封容器中市售的CRM时（⼤多数实验室已经采⽤这种形式）则不存在这种⻛险。

此外，除了某些特定情况外，烟酸不能被视为重铬酸钾的“替代品”。⾸先，重铬酸钾可以证明是⼀种更通⽤的吸光度参考，因为它可以在更宽的波⻓范围（235-430nm）内以五个间隔良好的波⻓进行认证，⽽烟酸只有两个波⻓，即213nm和261nm。因此，有更⼤的空间可以“限定”标准中推荐的分析波⻓。

其次，也许更重要的是，烟酸光谱受光谱带宽的显著影响。图1显示了带宽对不同带宽设置下烟酸溶液和重铬酸钾溶液测量值的影响。

可以看出，烟酸峰在261 nm处的吸光度值（此处推荐⽤于仪器鉴定）受到带宽的严重影响，实际上，这种影响远远⼤于合规允许的公差。重铬酸钾在类似波⻓处的吸光度值受到的影响要⼩得多。

因此，重要的是，使⽤烟酸进行的定性测量应在与⽤于确定参考材料值的带宽设置相同的带宽设置下进行。10.0给出了由“设备鉴定⽤烟酸CRS”制备参考溶液的程序。这种物质可从 EDQM以固体形式获得。按照说明制备溶液后，⽤⼾可根据随附证书中给出的“特定吸光度”计算参考吸光度值。不幸的是，所⽤固体重量的允许变化将导致最终溶液浓度不准确，从⽽导致计算出的吸光度不正确。此外，证书未指明⽤于确定特定吸光度的带宽，因此认证值几乎没有意义。仪器可能⽆法达到合规性，仅仅是因为在不知情的情况下使⽤与⽤于确定证书值的光谱带宽不同的光谱带宽进行定性测量。没有关于制备溶液后的稳定性或有效期的指导。因此，如10.0中所述，这种物质的使⽤不太可能作为吸光度参考。幸运的是，市售烟酸CRM可⽤，通常可以在客⼾要求的任何带宽下进行认证。如果使⽤得当，烟酸是远紫外线中有⽤的吸光度参考，但不能取代较高波⻓下的重铬酸钾。

为了符合要求，测量的吸光度和参考材料的实际吸光度之间的允许差异为±0.010 A或±1%（以较⼤者为准），并且“应验证预期吸光度范围的两个极限值左右”。

此公差适⽤于高达2A的吸光度值，建议“根据⻛险评估”处理更高的吸光度，但未提供更多详细信息。在这种情况下，烟酸和重铬酸钾CRM的可追溯认证值分别高达2.5A和3.5A，因此可以在这些较高水平下放⼼地进行直接鉴定（图2和3）。

控制光度测定的准确性和/或可⻅光区域的线性可以通过使⽤固体玻璃滤光片CRM来实现，但与之前的版本（9.2）不同，除了说可以使⽤“合适的固体或液体滤光片”之外，没有给出关于可⻅光区域标准的具体指导。上⾯对波⻓的评论也适⽤于此处，因此，如果建议的CRM 更适合⽤于分析的操作条件，则可以使⽤除建议的CRM以外的CRM。

吸光度线性的控制

准确度可⽤于验证线性，前提是它们与分析波⻓和吸光度范围兼容。以烟酸为例，其范围为5-40mg/L。EP未说明在所需吸光度范围内要测量的标准品的数量，但相关系数（R2）为 0.999，以符合要求。如何满⾜此要求由实验室决定。幸运的是，有⼀个明确的国际公认的ISO标准，即ISO 11095。“使⽤参考材料进行线性校准”，其中指出⽤于评估校准功能的参考材料数量⾄少应为三个。同样，最新的USP章节<857>仅规定，⾄少三个涵盖所需吸光度范围的参考值应满⾜所需的吸光度准确度标准。对于有限的吸光度范围（例如高达1A），三个参考值可能就⾜够了，但⽤⼾在使⽤更高吸光度时可能会决定使⽤更多参考值。使⽤CRM时，⽤⼾应记住在评估线性时将测量值与认证值进行⽐较，⽽不是与浓度进行⽐较。

杂散光控制

标准规定：“使⽤合适的固体或液体滤光⽚或内 部制备的溶液，在适当的波⻓下测定杂散光”。 上⼀版（9.2）仅提及⼀种杂散光参考，即12g /L氯化钾溶液，这是⼀种截⽌滤光⽚，指示198nm处的杂散光。现在，已确定了四种不同的水溶液，它们可以在198nm⾄370nm的波⻓范围内检测杂散光（表3）。

测试将使⽤水作为空白进行，并且观察到“⽤于测试的仪器参数，例如狭缝宽度和光源类型（例如氘灯或钨灯），必须与实际测量的参数相同”。所有这些参考材料都可以作为CRM使⽤。

分辨率控制（光谱带宽）

本测试与上⼀版相同。专论中，仪器的分辨率可以通过记录0.02% v/v甲苯在己烷（或庚烷）中的光谱来确定，该光谱的吸光度最⼤值为269 nm，最⼩值在267 nm。269 nm处的最⼤值与267 nm 处的最⼩值的⽐率应如专论中所述。不过，作为⼀般指导，图4显示了在不同带宽下的典型谱图，表4显示的是仪器带宽的有⽤指南。

庚烷的毒性⽐己烷低，因此建议作为替代溶剂。但是，如果测试材料是作为密封式CRM购买的，则这不是问题。该标准不再包含针对导数光谱法推荐的分辨率测试。

系统适⽤性

此新条款规定：“在样品测量之前可能需要进行系统适⽤性测试，以验证可能对结果产生影响的关键参数。这些测试可能涵盖波⻓准确度、吸光度准确度、杂散光和吸光度线性。系统功能测试（例如作为设备⾃动测试的⼀部分执行的测试）可被视为系统适⽤性测试的⼀部分。”

几种分光光度计型号都集成了⼀定程度的⾃动⾃检功能。⼀个典型的例⼦是使⽤光源灯（氘灯或氙灯）发射的特征谱线来提供波⻓检查。然⽽，如上所述，这些检查仅在可⻅光区域进行，⽤⼾必须决定此类测试是否能够“验证关键参数”到所需的程度。如果不能，则意味着可能还需要与分析⼀起执行前⾯描述的部分或全部验证测试。

参考材料：CRM还是内部准备的？

直到 20 世纪 70 年代，⼤多数实验室都使⽤内部制备的溶液或专有测试材料来检查其仪器的性能，或依靠制造商校准其仪器作为⽇常维护的⼀部分。现在，监管的国际性质要求校准必须具有国际有效性，这意味着使⽤普遍认可的标准进行校准。由认证供应商根据国际规范制备的CRM具有这种有效性。仪器⽤⼾仍然完全可以制备⾃己的参考溶液，并且本标准中给出了说明，但与使⽤CRM相⽐，这可能是⼀个复杂的过程，有许多陷阱。显然，参考值的准确性将取决于所⽤材料的纯度以及称重和稀释等制备过程的准确性。因此，在制定标准并因此确定参考值总体不确定性的过程中，建立“不确定性预算”是正常的，但这也可能很复杂。大多数实验室决定使用商业标准物质（CRM），这些物质的所有不确定性都已在证书上标明，这一点或许并不令人惊讶。

什么是CRM？

根据 ISO/REMCO（国际标准组织标准物质委员会）的定义，CRM 是⼀种“标准物质，其特征是针对⼀个或多个指定属性的计量有效程序，并附有标准物质证书，该证书提供指定属性的值、其相关的不确定性以及计量可追溯性的声明。”

最初，唯⼀可⽤于分光光度计校准且具有国际公认特性值的参考来自国家计量机构 (NMI)，例如美国国家标准与技术研究所 (NIST)，其产品被注册为标准参考材料 (SRM)。无论如何，良好实验室规范和类似质量⽅案的出现导致对SRM的需求增加，超过了生产能⼒NMI的生产能⼒。商业化生产的标准物质是可⽤的，但不⼀定被监管机构接受，因此⼀些生产商与监管机构合作开发标准物质，这些标准物质将被认可为与 SRM 等效，⽤于校准⽬的。此类材料将被称为CRM，并将得到国家和国际监管机构或认证机构的认可。这些 CRM 可以作为溶液生产，永久密封在UV质量比色皿中，⽤于直接进行合格测量。这不仅使⽤⼾免于准备参考溶液的任务，⽽且实际上消除了直接处理参考材料可能产生的任何危险。

此外，与内部参考材料不同，CRM的认证值不依赖于参考材料的制备精度，⽽是依赖于在参考仪器上执行的校准，该仪器本⾝已根据主要物理标准或SRM进行了校准。证书值当然会受到校准仪器的任何变化的影响，但这可以由生产商确定并在CRM随附的证书上注明。校准证书中通常给出的“扩展不确定度预算”是测量参数的预期不确定度，通常以95%的置信度表⽰。

有了这些信息，仪器验证就变得非常简单了。当使⽤CRM验证仪器时，总允许公差是证书不确定度和仪器制造商指定的仪器准确度之和，见表5。

如果测量值与认证值之间的差值小于总公差，则可以判断仪器运行正常。当然，差异也应该小于所使⽤的药典或分析专论允许的误差。

如今，制药行业的大部分仪器验证都是使⽤CRM进行的。事实上，美国药典在其第<857>章中指出，“只要可能⋯⋯应优先使⽤CRM，⽽不是实验室制备的溶液”。根据新法规定制备的CRM套件，这为这种⽅法增添了便利。

可追溯性非常重要，因为它赋予CRM国际公认参考的权威性，其校准最终可追溯到这些参考。ISO/IEC指南 99:200710将其定义为“测量结果的属性，通过记录的连续校准链，结果可以与参考相关联，每⼀个都会增加测量不确定度”。因此，CRM供应商⽤来建立认证值的参考分光光度计必须符合合适的SRM或主要物理参考（如元素发射线）。所使⽤的参考应在CRM随附的证书上注明。参考材料的稳定性也很重要，校准的有效期应在CRM证书上注明。这通常是两年，但也可能更短，具体取决于实验室的质量协议。应定期进行重新认证以保持认证的有效性。为了让⽤⼾对购买的CRM有信心，其供应商应获得ISO 17034:2016“标准物质生产商能⼒通⽤要求”的适当认证。这是最低要求，涵盖质量和管理系统以及技术和制造操作。该标准包括对另⼀项标准的规范性引⽤：ISO/IEC 17025:2017“检测和校准实验室能⼒的⼀般要求”。ISO 17025规定了报告和评估测量不确定度的程序，任何合格的生产商也应获得该标准的认证。ISO 17025认证包括⼀份“范围”声明，列出了实验室有能⼒校准的参考材料。有意向的购买者应检查其拟议供应商的认证范围是否包括相关材料：ISO 17025认证可能仅基于⼀种材料或校准过程，⽽这可能不涵盖要购买的物品。

结论

与新的USP通则<857>⼀样， EP 2.2.25的第10.0版已大大扩展了标准，更加强调了紫外可见光仪器的“适⽤性”。现在必须证明仪器具有在⽤于分析的操作参数下充分发挥作⽤所需的性能。为此，给出了合适参考材料的⽰例，但建议的材料并不涵盖所有情况。标准的解释也存在不确定性，特别是在涉及吸光度准确度和线性的部分。建议使⽤烟酸作为吸光度参考，但给出的烟酸制备数据存在缺陷，因为它不准确，并且没有考虑光谱带宽的影响。在实践中，许多情况下无法实现新规范之⼀（⽐色⽫光程⻓度）。然⽽幸运的是，该标准允许使⽤⽬前市⾯上非常⼴泛的CRM进行仪器鉴定。明智地选择这些材料有时会⽐标准中引⽤的参考⽂献更好地与所使⽤的分析⽅法保持⼀致，从⽽更好地证明“适⽤性”，为实现合规性提供了更直接、更⽅便的途径。

                                                                                 内容来源：百博思BPA编辑整理

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