准确测定药品和药品中的寡核苷酸的含量，对确保生产质量和患者的安全至关重要。随着目前反义和短干扰RNA（siRNA）治疗的研究活动呈指数级增长，需要一种可靠的方法来准确地定量给药溶液。生产产品的规模从毫克到公斤不等。如果定量方法不准确，除了由于剂量不正确而危及患者的安全外，还可能由于不准确的产量信息而产生经济影响。由于寡核苷酸的吸湿性和静电性质，重量测量不适用于微量的样品。测定寡核苷酸浓度的常规方法通常依赖于紫外吸收度的测量，这与分子的一个基本性质有关。摩尔消光系数，也称为摩尔吸收率ε，是一种测量化学物质在给定波长下吸收光的强度。这是物质的固有属性；根据比尔-兰伯定律，样品的实际吸光度A取决于路径长度l和物种的浓度C- A = εCl
寡核苷酸的摩尔消光系数是一种独特的物理性质，由其序列、温度、pH值和其溶解的缓冲液或溶剂的性质决定。虽然在最大值处的摩尔消光系数更准确，一般来说，一个寡核苷酸的消光系数是在波长为260 nm，即ε260。光密度（OD）是核酸化学家使用的一个较古老的术语。光密度单位，或更常见的是OD，或者OD260，是寡核苷酸的吸光度测量。由于核酸链上的共轭双键体系，核酸链中的每个碱基在260纳米处或附近具有吸光度。因为确切的碱基序列和组成是已知的，OD260单位是一种非常准确和方便的测量方法来定量寡核苷酸。OD260单位是一个归一化的测量单位，定义为使用1.0 cm光程长度的比色皿在1.0 mL溶液中获得260 nm处的吸光度值为1所需的寡核苷酸量。例如，考虑一个分子量为14303.6 g/mole的双链siRNA，其摩尔消光系数为296843 M-1cm-1。使用A = εCl的关系，以及在1.0 mL溶液下的吸光度读数为1.0，OD260相关内容如下：nmole/OD260 = (1/296843)*106= 3.4
μg/OD260 = 14303.6*(1/296843) = 48.2
组合化学方法的快速发展导致了大量适合治疗使用的序列。这种活性需要快速计算消光系数和其他热力学参数来设计寡核苷酸。由寡核苷酸生产商、大学和卫生机构开发的几种基于网络的计算器可供研究人员使用。本章将回顾消光系数的理论计算的来源，并为直接测定寡核苷酸的消光系数提供实验细节。
计算ε260
采用Schneider方法测定哺乳动物组织和微生物中核酸的化学测定方法。用热三氯乙酸（TCA）提取核酸。总核酸（TNA）通过测定提取物在260 nm处的吸光度和测定提取物的磷含量。用对硝基苯肼反应测定DNA。采用紫外吸收法作为快速测定TNA的方法。三羧酸水解可以广泛和重复地变性核酸。采用TCA水解和紫外吸收法分析组织和微生物中的TNA，并校正TCA吸收。已发表的单核苷酸和二核苷磷酸盐的摩尔消光系数构成了大多数现代合成寡核苷酸消光系数计算的基础。寡核苷酸的消光系数通常可以用四种方法之一来计算。随着复杂性的增加，它们是：
1. 无论碱基组成或序列如何，该方法假设单链寡核苷酸的标称浓度33 μg/mL，具有1个单位吸光度。该方法可以方便地用于计算寡核苷酸的粗产率。
2. 第二种方法假定寡核苷酸结构中的所有核苷酸与溶液中的游离核苷酸具有相同或相似的摩尔消光系数。这种近似只有在寡核苷酸不具有任何二级结构时才有用。总和是在单链中存在的所有类型的碱基上计算的。此外，在双链核酸中所有类型的碱基对中，使用4个单核苷酸磷酸和可能的16个单磷酸二核苷的消光系数值进行计算。利用表12.1给出的260 nm单核苷酸和二核苷磷酸公布的ε260值，计算9聚寡核苷酸GGC UCU UAG的ε260值如下图所示：
eG + eG + eC + eU + eC + eU + eU + eA + eG
11500 + 11500 + 7200 + 9900 + 7200 + 9900 + 9900 + 15400 + 11500 = 94000 M-1cm-1
3. 除了简单的核苷酸消光系数总和外，建议将单个碱基的消光系数总和乘以系数0.9。这是由于单链中的碱基堆叠相互作用，相对于根据单个核苷酸消光系数计算出的值，会抑制DNA的吸光度。双链的这种影响更大，自互补序列的倍增因子约为0.8。这些数字是对典型DNA 序列的估计。
4. 文献中报道的分离核苷碱基的光吸收是在高稀释的溶液中测量的。当这些碱基与邻近碱基相邻时，它们会发生明显的变化，从而在寡核苷酸中形成有序的二级结构。在这种有序结构中，碱基可以面对面堆叠，从而共享 π-π 电子相互作用，这对碱基的过渡偶极子产生了深远影响。更重要的是，碱基堆叠会导致ε减小，即所谓的低色度。第四种方法考虑了碱基组成和序列顺序，并对堆叠因子进行了修正。这被认为是基于最近邻（第一邻）模型的更精确方法。利用表12.1 中的值，用近邻校正法计算9聚体 GGC UCU UAG 的ε260如下：
eGG + eGC + eCU +eUC + eCU + eUU + eUA + eAG - (eG + eC + eU + eC + eU + eU + eA)
21600 + 17400 + 2*16200 + 17200 + 19600 + 24600 + 25000 - (11500 + 7200 + 9900 + 7200 + 9900 + 9900 + 15400) = 86800 M-1cm-1
基于近邻参数的计算可随时预测寡核苷酸的热力学性质。DNA和RNA的单核苷酸和双核苷酸的消光系数是在波长为260 nm、温度为25°C、pH值为中性的水中测定的。
Richard Owczarzy等人开发了一套综合生物信息学工具，用于预测原生核酸和化学修饰核酸的特性，并协助设计这些核酸。在线工具OligoAnalyzer 3.1具有计算单链DNA和RNA摩尔消光系数的功能。此外，还应用最近邻模型预测吸光度光谱，说明消光系数与波长的函数关系。还开发了另一种在线计算器，用于计算DNA和RNA（包括单链和双链）的特性，包括分子量、溶液浓度、熔化温度和估计吸光系数。
计算得出的消光系数与实验得出的数值相差高达10-20%。这些差异可能是由于单核苷酸和二核苷酸磷酸盐值所使用的数据不准确，以及假定同源DNA和RNA单核苷酸的ε260值相同。Kallansrud和Ward报道的消光系数测定方法依赖于NaOH对RNA的水解。此外，DNA是用蛇毒磷酸二酯酶（SVP）或SVP/DNase I的混合物水解的。以水解为基础的ε260 实验测定依赖于寡核苷酸的完全水解和单体核苷酸消光系数的准确性。此外，随着目前合成寡核苷酸碱基修饰和共轭化学的进步，这些寡核苷酸可能不易水解。而且，水解可能会导致未知途径的降解。
Cavaluzzi和Borer通过1H-NMR确定核苷-5′-单磷酸的浓度，提高了消光系数的准确性。Cavaluzzi-Borer对260 nm波长DNA碱基消光系数的校正已纳入Integrated DNA Technologies (IDT) SciTools。
缓冲液的影响
寡核苷酸消光系数计算器得出的结果是基于溶解在pH值为7的水中的寡核苷酸的数据，离子强度可变，具体取决于选择使用哪种计算器。根据实际经验，在水中进行的测量并不准确。图12.1 展示了siRNA在水中、1xPBS中和0.9%生理盐水中（浓度均为2 μM）的动力学实验中测得的260 nm吸光度的变化。siRNA 在磷酸盐缓冲液（PBS）和 0.9% 生理盐水中的吸光度迅速达到平衡，并呈现恒定的吸光度读数。然而，水溶液的吸光度在10分钟内随着时间的推移持续上升，并没有稳定下来，这表明寡核苷酸在水介质中没有达到平衡。在控制良好的质量控制（QC）实验室中制备的寡核苷酸水溶液的吸光度重复测量的精确度，根据测量之间的间隔，会有1-2%以上的变化。如图12.1所示，在盐缓冲液中进行的测量比在水中进行的测量精确一个数量级。
图12.1 吸光度随时间变化的曲线图：2 μM siRNA在水中的平均吸光度为0.6872，%RSD为0.90，2 μM siRNA在0.9%生理盐水中的平均吸光度为0.5071，%RSD 为0.06，2 μM siRNA在1xPBS中的平均吸光度为0.4930，%RSD为0.06。所有测量均在25°C和260 nm波长下进行。
水溶液中的siRNA双链部分变性为有义链和反义链。由于这是一种动态平衡，总吸光度（双链与单链之和）会随着时间的推移而变化。图12.1 中的吸光度随时间变化的函数清楚地显示了siRNA有序的原生结构与无序的变性状态之间的转变，从而产生了高色度效应。在生理盐水或1xPBS溶液（最常用的肠外给药溶液）中发现的盐分存在时，siRNA的吸光度相对于其组成的单链是低色的。在盐溶液中重复测量吸光度将提供更多可重复的结果。由于消光系数的计算值与实验值相差10-20%，建议在0.9%的生理盐水中直接测定ε260。一般来说，使用0.9%的生理盐水可为大多数RNA 双链提供可靠的数据。——节选自《Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products》
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