原文要点

• 制备色谱的各个步骤使用PAT监测；

• 可变光程的紫外/可见光谱用于入线测量，测量的蛋白质浓度达75 g/L；

• 通过偏最小二乘回归法（PLS）进行蛋白质的选择性定量；

• 通过PLS模型的计算来控制纯化步骤。

• 摘要

  在蛋白质制备色谱中，蛋白质浓度的宽动态范围，以及产品和杂质的共洗脱现象是很常见的。尽管制备色谱是生物制药生产的标准，但对其监测通常使用的是替代信号，如280nm处的紫外吸收。为了解决这个问题，可变光程（VP）光谱与偏最小二乘回归法（PLS）相结合，被用来监测制备色谱。本研究中，该方法先是用于监测溶菌酶（Lys）与细胞色素c（Cyt c）在92 g/L的总装填密度下的分离。然后，同样的方法被应用于单克隆抗体（mAb）在40 g/L装填密度下的抛光步骤。对于mAb单体和高分子量变体（HMWs）的PLS模型预测，均方根误差（RMSE）分别为1.07 g/L和0.42 g/L。总之，VP光谱与PLS建模相结合，是未来大规模入线监测和控制色谱步骤的一个有前途的选择。

  
  

  介绍

  在当前的生物制药纯化过程中，制备液相色谱法是从含培养基成分、DNA、宿主细胞蛋白质和产品相关杂质中分离出目标产品的关键。使用这种方法是因为它的高分离能力，同时还可更大限度地减少产品损失。

  制备色谱过程通常在高装填密度下运行，以实现高效过程。高的装填密度随后会导致从柱上洗脱的蛋白质馏份的浓度范围很广。因此，监测技术必须具有很宽的动态范围，以捕获峰值浓度以及峰侧较低浓度的杂质。此外，由于制备色谱的分辨率有限，产品和杂质之间的基线分离很难实现。因此，PAT技术应选择性地量化产品和主要杂质。由于色谱法的快速变化，色谱法过程中的决策时间是很有限的。

  目前有许多不同的文献方法被用于了色谱的实时监测。制备色谱的在线监测和控制，已通过高效液相色谱自动取样和后续分析实现。制备液相色谱中的宽浓度范围可以通过改变进样量来轻松控制。但缺点是，由于样品处理和分析时间以及污染风险的影响，会造成时间的延迟。

  此前，紫外/可见光谱已被提议作为色谱过程入线监测的方法。它对模型蛋白质的多组分混合物和实际分离问题都很有用。为了增加光谱采集的动态范围，设计出了新的测量池，它允许连续改变光程的长度，以实现几乎任何分析物的浓度，并具有理想的灵敏度。这种方法与PLS建模相结合，成功地用于监测废水的化学需氧量。该方法由一家商业供应商进一步开发，用于了蛋白质的相关应用，可以在广泛的浓度范围内测量蛋白质光谱，测得的蛋白浓度可达250 g/L。最近，有供应商又推出了一条用于入线可变光程（VP）测量的产品线。该设备能够提供高达约80 AU/mm吸光度的测量结果，对应于近600 g/L的mAb浓度。

  本研究展示了通过UV/Vis 可变光程光谱结合PLS建模对制备色谱进行入线监测。VP光谱可以在几乎任意的蛋白质浓度下监测色谱过程，且PLS模型可以从光谱数据中选择性地量化多个共洗脱组分。本研究中，该方法先是用于在高装填密度下分离模型蛋白：溶菌酶（Lys）和细胞色素c（Cyt c）的混合物。前者是产品，后者是污染物。

  随后，使用该方法监测了mAb单体及其HMWs的制备抛光步骤。为了证明这种方法在过程控制方面的有效性，根据模型系统的洗脱蛋白的预测浓度或单抗的计算纯度，对这两个分离案例中的产品池进行了入线控制。

  
  

  材料和方法

  色谱仪器

  制备色谱实验均是在配有样品泵S9的ÄKTA Pure 25系统上进行。另外，使用FlowVPE可变光程的紫外/可见分光光度计（C Technologies, Bridgewater, USA）监测色谱柱的流出物，它被整合到AKTA系统的电导率监测器和分数集电器之间的流程中。使用Dionex UltiMate 3000快速分离液相色谱系统对收集到的馏分进行分析。

  可变光程色谱

  FlowVPE可变光程光谱仪使用一根可移动的光纤来改变流通池的光程L（图1）。一个可变光程的测量周期包括一个筛选阶段和一个随后的采集阶段。在筛选阶段，根据在280 nm处的5、25、100 μm三个光程的3次测量值，仪器会计算出采集阶段的更佳光程。

  

  图1可变光程光谱法：每个测量周期，通过驱动FlowVPE的光纤来实现可变的光程L。在确定更佳测量光程的筛选阶段结束后，仪器会测出5个不同光程的紫外吸光度。接着计算每个波长的斜率，给出一个斜率值。然后产生一个三维的（时间，波长，斜率）的色谱图。

  
  

  在采集阶段，仪器于五个不同的光程位置上测得对应的吸光度Aw,i（i取值在{1，2，3，4，5}；w为选定的波长）。基于郎勃-比尔定律，假设吸光度估计值Ãw与光程L之间存在线性相关（公式（1））。那么，通过公式（2）中的最小二乘问题，可以估计出斜率mw和截距bw。

  

  由于斜率是在整个色谱运行过程中得出的，而且实验结果是由时间、波长、斜率确定的，因此它是一个三维的色谱图。通过等式（1）和郎勃-比尔定律，可以导出以下等式（3）。

  

  这表明，斜率与蛋白质浓度C、消光系数ew相关。由于只考虑斜率，因此光纤的偏移对最终结果没有影响。一般来说，对于中紫外光谱的测量时间大约需要30秒。

  实验案例

  文章研究了Cyt c与Lys的分离、从mAb单体中分离HMWs两个案例，实验详细步骤见原文。

  
  

  结果与讨论

  如实验所述，在两个案例研究中都进行了不同光程下的线性梯度测量，以得到不同的混合比和被检测蛋白质的浓度。

  可变光程光谱法在色谱分析中的应用

  在可变光程光谱法中，仪器在不同的光程下测量吸光度。图2A为280 nm处的典型色谱图。绿线表示不同光程下随时间变化的吸光度。相应的光程用灰色线表示。用橙色表示随时间变化的斜率。如图等式（3）所示，斜率与总蛋白浓度呈线性关系。值得注意的是，在蛋白质洗脱过程中，吸光度值几乎保持不变，而光程则减少。在筛选阶段，选择测量阶段的更长光程，使其在280 nm处的吸光度约为1 Au。因此，设置的光程与斜率是成反比的，从而它也与蛋白质浓度成反比（图2A）。

  

  图2  用VP波谱得到的单波长（A）和多波长（B）的典型色谱图 A: 绿线表示在不同光程处获得的吸光度值（灰线）。在每个时间点，斜率（橙色线）由5个吸光度值和光程之间的线性确定。B: 如果在色谱运行过程中记录斜率，则得到三维色谱图。

  
  

  图2A显示了一个波长的典型色谱图，而图2B显示了多个波长的色谱图。它们不是单波长的斜率，而是斜率光谱。由于斜率是在整个色谱运行过程中产生的，这导致得出了在（时间、波长、斜率）处的三维色谱图。所得到的三维色谱图是PLS模型校准和确认的起点。

  案例1：Cyt c与Lys的分离

  由于芳香族氨基酸的质量分数以及Cyt c中血红素基团的不同，Cyt c和Lys的紫外光谱存在显著差异（图3A）。

  在交叉验证的基础上，选择2、3个潜在变量的Lys和Cyt c。三次校准运行（梯度长度为2、4和8 CVs）的PLS模型预测结果如图4A、B和D所示。这些图将Lys（蓝色实线）和Cyt c（红色实线）的PLS模型预测与相应的参照结果（蓝色条为Lys，Cyt c）进行了比较。在所有校准运行的PLS模型预测和参考模型之间都有很好的一致性。

  

  图3  案例研究I（A）和案例研究II（B）的蛋白质斜率的比较。

  

  图4  将lys和cyt c的PLS模型预测与（A）2 CV、（B）4 CV、（C）6 CV和（D）8 CV梯度长度的离线参照结果进行比较。PLS模型预测的蓝色和红色阴影说明了平滑的效果。

  
  

  为了确认该模型，我们对6 CV梯度运行进行了预测，并密切遵循相应的参照（图4C）。图4中PLS模型预测的不同蓝色和红色阴影说明了非平滑和平滑数据（非平滑数据颜色较浅，平滑数据颜色较深）。Cyt c的RMSE为0.53 g/L，Lys为1.11 g/L。使用Savitzky-Golay滤波器的平滑预测数据，Cyt c 的RMSE为0.48 g/L，Lys为1.05 g/L。应用Savitzky-Golay滤波器明显改善了预测Lys和Cyt c的RMSE（表1）。

  VP光谱和PLS模型的结合允许在色谱柱中选择性定量Lys和Cyt c，峰浓度高达80 g/L。说明该方法适用于制备色谱的典型浓度范围。

  案例2：从mAb单体中分离HMWs

  与Cyt c和Lys相比，mAb单体和HMWs可能含有相同质量分数的芳香族氨基酸和二硫键桥。因此，光谱的差异要么与三级结构的变化有关，要么与光散射有关。因此，mAb单体和HMWs的光谱差异相对较小（图3B）。这使得通过PLS建模的量化更具挑战性。

  在交叉验证的基础上，mAb单体采用4个潜在变量的PLS1模型，HMWs采用8个潜在变量的PLS1模型。图5A、C、D显示了三次校准运行（梯度长度为4、6、7 CVs）的PLS模型预测，而图5B显示了确认运行的结果（5 CV梯度）。图中显示了mAb单体的PLS模型预测（实蓝线）和HMWs（实红线）与参照结果（蓝条为mAb单体，红条为HMWs）的比较。在所有四次运行中，模型预测与参照非常匹配。结果表明，该方法对蛋白质的适用性，在吸收光谱上只有轻微的差异。mAb单体的预测RMSE为1.26 g/L，HMWs的预测RMSE为0.50 g/L。通过使用Savitzky-Golay滤波器平滑数据，可以进一步降低RMSE。这使得mAb单体的RMSE值为1.07 g/L，HMWs的RMSE值为0.42 g/L。图4比较了所有运行的非平滑数据和平滑数据。应用Savitzky-Golay滤波器改善了预测mAb单体和HMWs的RMSE（表1）。

  入线池化决策

  为了显示VP光谱学与PLS建模的有效性，把所实施的方法用于了过程决策。在这两个案例研究中，对色谱运行都进行了带有过程干扰的池化决策。

  收集到的池通过离线检测进行分析，都可以做出准确的预测，但会有微小的偏差。对于Cyt c和Lys的分离，预测其纯度为99.0%，而离线分析测定的纯度为99.7%。对于mAb单体产品池，PLS模型预测的纯度为94.4%，而通过离线分析测量的纯度为94.2%。在这里，Savitzky-Golay滤波并没有使预测得到改进，这是因为测量噪声会随着时间的推移而自我抵消（表2）。

  

  图5  将mAb单体和HMWs的PLS模型预测与（A）4 CV、（B）5 CV、（C）6 CV和（D）7 CV梯度长度的离线参照结果进行比较。PLS模型预测的蓝色和红色阴影说明了平滑的效果。

  

  表1  RMSE表示两个案例研究的确认运行中的预测：将未过滤预测的RMSE与过滤数据的RMSE进行比较。

   

  图6  在案例研究I（A）和案例研究II（B）的入线对照运行中，PLS模型预测的蓝色和红色阴影说明了平滑的效果。根据非平滑的数据，计算出池的纯度（黑色）。这些细的黑色竖线表示池化的开始和结束。

  

  表2  对于这两个案例研究，基于PLS模型预测纯度，并与离线分析的相应结果进行比较。

  以上结果表明，该方法可用于色谱系统的入线控制。使用的保留时间为10min，高于工业标准。在洗脱过程中降低流速是合理的，因为洗脱阶段相对于整个过程相对较短。另外值得注意的是，这里所讨论的方法要比文献中提出的在线HPLC PAT方法要快得多，因为在生产规模中，在线HPLC的响应时间减慢了约2.5倍到3倍。

  结论与展望

  本研究成功地实现了制备色谱法的入线监测。研究表明，可变光程的紫外/可见光谱和PLS模型的结合，允许在很宽的浓度范围内入线进行蛋白质的选择性定量。该方法还可以监测高装载色谱柱的运行，产品峰值浓度在30 g/L至80 g/L之间变化，而污染物峰值浓度为4 g/L至20 g/L。总之，该方法具有对制备色谱法的入线监测和控制的潜力，它也可以适用于连续色谱法中对时间切换的控制。